一、模式動物
隨著人類基因組計劃的完成和后基因組研究時代的到來,模式生物的研究策略得到了廣泛的應用,基因的結構和功能可以在其它合適的生物中去研究,同樣人類的生理和病理過程也可以選擇合適的生物來模擬,在科研領域,常見的模式動物除開廣泛應用的大小鼠外,還有斑馬魚,非洲爪蟾,果蠅,線蟲應用*為廣泛。由于他們各自獨特的優(yōu)點,被應用于遺傳學的研究、發(fā)育生物學的基因調控的研究、各類**的研究如帕金森氏病、老年癡呆癥、**成癮和酒精中毒、衰老與長壽、學習記憶與某些認知行為的研究。
1、斑馬魚
脊索動物門( Chordata)、輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)魚丹屬(Danio)斑馬魚(D. rerio)。體長 4~6 厘米。體呈紡錘形。背部橄欖色,體側從鰓蓋后直伸到尾未有數(shù)條銀藍色縱紋,臀鰭部也有與體色相似的縱紋,尾鰭長而呈叉形。雄魚檸檬色縱紋;雌魚藍色縱紋加銀灰色縱紋。斑馬魚模式生物的使用正逐漸拓展和深入到生命體的多種系統(tǒng)(例如,神經(jīng)系統(tǒng)、**系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等)的發(fā)育、功能和** (例如,神經(jīng)退行性**、遺傳性心血管**、糖尿病等)的研究中,并已應用于小分子化合物的大規(guī)模新藥篩選。斑馬魚作為模式動物的優(yōu)點如下:
(1)斑馬魚的繁殖周期約 7 天左右,一年可連續(xù)繁殖 6-7 次,而且產(chǎn)卵量高其繁殖力很強。
(2)由于斑馬魚基因與人類基因的相似度達到 87%,這意味著在其身上做**實驗所得到的結果在多數(shù)情況下也適用于人體,因此它受到生物學家的重視。
(3)斑馬魚的胚胎是透明的,所以生物學家很容易觀察到**對其體內器官的影響。
(4)雌性斑馬魚可產(chǎn)卵 200 枚,胚胎在 24 小時內就可發(fā)育成形,這使得生物學家可以在同一代魚身上進行不同的實驗,進而研究病理演化過程并找到病因。
2、非洲爪蟾
屬脊索動物門 (Phylum Chordata)、無尾目 (Salientia)、負子蟾科 (Pipidae) 雄性成蛙體長 7-11 cm,雌性成蛙體長 9-14 cm。性成熟的成蛙前肢有黑色婚墊,便于交配,雄蛙泄殖腔比雌蛙泄殖腔小。非洲爪蟾學名 Xenopus laevis 負子蟾科。由于沒有舌頭只能利用其前肢攪食水中的無脊椎動物 。分布于由南非的熱帶草原起,北至肯尼亞,烏干達西至喀麥隆。體長 100 mm。雄性會比雌性小一截,后肢具有 3 對角質腳爪。非洲爪蟾作為模式動物的優(yōu)點如下:
(1)在胚胎學研究中,非洲爪蟾是主要的兩棲類動物模型。非洲爪蟾的優(yōu)勢在于取卵方便,在實驗室條件下,它可以常年只要注射**,雌體第 2 天就可以產(chǎn)卵,而且產(chǎn)卵量很大,可以通過人工授精獲得受精卵。
(2)非洲爪蟾的卵子和胚胎個體較大,非常適宜于進行實驗胚胎學研究,如顯微注射、胚胎切割和移植等。其早期胚胎發(fā)育很快,在 24℃ 下受精后 2 天左右就可以孵化成可以自由游動的幼蟲。
(3)非洲爪蟾的成熟卵子具有明確的動物極和植物極,受精作用引起皮質運動。爪蟾胚胎經(jīng)過卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、尾芽期等階段孵化成幼蟲;蝌蚪在 5 天左右后肢開始發(fā)育并逐漸進入變態(tài)期,到兩個月時完成變態(tài)。幼體要生長 1 到 2 年才能達到性成熟。產(chǎn)卵,不受季節(jié)限制。
3、果蠅(Drosophila,fruit fly, Drosophila melanogaster)
屬節(jié)肢動物門、昆蟲綱、雙翅目、果蠅屬、果蠅種。約 1,000 種。廣泛用作遺傳和演化的室內外研究材料,尤其是黃果蠅 (D. melanogaster)。果蠅作為模式動物的優(yōu)點如下:
(1)飼養(yǎng)容易,用一只牛奶瓶,放一些搗爛的香蕉,就可以飼養(yǎng)數(shù)百甚至上千只果蠅;
(2)繁殖快,在 25℃ 左右溫度下十天左右就繁殖一代,一只雌果蠅一代能繁殖數(shù)百只。果蠅只有四對染色體,數(shù)量少而且形狀有明顯差別;
(3)果蠅性狀變異很多,比如眼睛的顏色、翅膀的形狀等性狀都有多種變異,這些特點非常有利于遺傳學研究。
4、線蟲
亦稱圓蟲 (roundworm)。屬線蟲動物門 (Aschelminthes) 線蟲綱 (Nematoda) 所有蠕蟲的通稱,系動物界中數(shù)量*豐者之一,寄生于動、植物,或自由生活于土壤、淡水和海水環(huán)境中。通常呈乳白、淡黃或棕紅色。大小差別很大,小的不足 1 毫米,大的長達 8 米。線蟲作為模式動物的優(yōu)點如下:
(1)線蟲生活在土壤間水層,成蟲體全長只有 0.1 公分,因以**為食物,所以在實驗室中極易培養(yǎng)。
(2)線蟲全身透明,研究時不需染色,即可在顯微鏡下看到線蟲體內的器官如腸道、生殖腺等;若使用高倍相位差顯微鏡,還可達到單一細胞的分辨率。因此,線蟲是研究細胞分裂、分化、死亡等的好材料。又因為線蟲僅有一千多個體細胞,所以它的所有細胞都可以徹底地觀察研究。
二、注射流程舉例(以斑馬魚胚胎顯微注射為例)
注射步驟:
1、注射針內裝液:使用無菌的微量加樣器從微注射針的后部加入待注射樣品酚紅一滴。
2、注射針安裝和定位:
(1) 將裝液后的針頭的游離端安在連接器上,然后旋緊連接器以固定針頭,再將其固定到微操作儀的托針管上;
(2) 把載有待注射樣本的培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺上,用低倍物鏡對準細胞調焦;
(3)移動針頭并在顯微鏡下調整微操作儀,直到針頭的陰影在視野的中心上方;
(4)使用工作用放大倍數(shù),調準細胞焦距,找到針尖。
3、顯微注射:
(1)使針尖對準細胞的待注射部位(細胞與針尖在同一焦面上),旋轉推進旋鈕,針刺入細胞內(卵膜、細胞膜、核膜);
(2)旋轉加樣旋鈕,將樣本加入,并離開細胞。
實驗結果:
三、模式動物胚胎操作相關的顯微注射設備
在應用模式動物(斑馬魚,非洲爪蟾,果蠅,線蟲等)進行相關胚胎操作過程中,需要使用高效可靠的顯微注射設備。根據(jù)注射驅動動力的不同,常見的系統(tǒng)包含液體壓力式注射系統(tǒng)以及氣壓式注射系統(tǒng)。
1、液體壓力式注射系統(tǒng)
該系統(tǒng)由液體壓力注射主機,控制器,手動三維位操作器,磁性底座以及固定鐵板組成。待注射樣本溶液(如 RNA)被機械推動的液體壓力推出針尖進口卵母細胞胞內。經(jīng)典的系統(tǒng)如美國 Harvard Apparatus 公司的 Nanoject 納升級注射系統(tǒng)。如下圖:
2、氣壓式注射系統(tǒng)
該系統(tǒng)由液體壓力注射主機,控制器,手動三維位操作器,磁性底座以及固定鐵板組成。待注射樣本溶液(如 RNA)被**可控的氣體壓力推出針尖進口卵母細胞胞內。
3、用于光遺傳實驗過程中的慢病毒注射的系統(tǒng)
以病毒轉染光敏蛋白為方法的光遺傳實驗同樣也需要微注射過程,將病毒以很慢的速度注射到大小鼠的腦區(qū)。這就需要推進精度很高的微注射系統(tǒng),如哈佛公司的注射泵等。