·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/ 研究·

冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

韋 斌1 ，王 強(qiáng)1 ，姜 浩2 ，朱志華1 ，陳廣琴1 ，尹 瑋1 ，駱 虹1

摘要: 目的        觀察冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的病理變化，進(jìn)一步證實(shí)冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 將 48 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥對(duì)照組、冠通方大劑量組、冠通方中劑量組、冠通方小劑量組，每組各 8 只。各組分別連續(xù)灌胃 14 d，制備左室心肌病理切片。比較各組病理切片在光鏡下心肌細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，使用原位末端標(biāo)記法( TUNEL 法) 測(cè)定各組凋亡細(xì)胞指數(shù)。結(jié)果 冠通方大、中劑量組心肌細(xì)胞在光鏡下的結(jié)構(gòu)形態(tài)得到較好的保護(hù)，冠通方大、中劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組顯著下降( P ＜0．05) 。結(jié)論    冠通方可以減輕心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞的損傷，有效減少心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

關(guān)鍵詞: 心肌缺血再灌注損傷; 冠通方; 機(jī)制研究

中圖分類(lèi)號(hào): Ｒ542．2    Ｒ285．5    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A    doi: 10．3969 / j．issn．1672-1349．2017．13．008    文章編號(hào): 1672-1349( 2017) 13-1569-04

心肌缺血再灌注損傷( myocardial ischemia reperfu- sion injury，MIＲI) 是心臟缺血性病變?cè)偻ê蟪Ｒ?jiàn)的并發(fā)癥，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理  等方面發(fā)生進(jìn)一步損傷，并可出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌細(xì)胞內(nèi) 凋亡基因的表達(dá)增高或心肌細(xì)胞凋亡。冠通方的近期 藥理研究表明［1］:  使用冠通方預(yù)處理可使缺血再灌注損傷( IＲI) 大鼠模型的損傷心肌組織中白細(xì)胞介素-8 ( IL-8) 表達(dá)下降，白細(xì)胞介素-10( IL-10) 表達(dá)增高，有效抑制炎癥機(jī)制及壞死機(jī)制，起保護(hù)心肌的作用。本 研究通過(guò)后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量的冠通方干預(yù)兔  心臟再灌注損傷后心肌細(xì)胞的凋亡及病理形態(tài)改變， 進(jìn)一步驗(yàn)證了冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 48 只新西蘭大白兔，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK( 桂) 2011-0003］，體質(zhì)量 2．5 kg ～ 3 kg，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后開(kāi)始分組。

1.2 實(shí)驗(yàn)** 冠通方組成: 田七 45  g，生曬參 100 g，丹參 150 g，地龍 150 g，全瓜蔞 150 g，絞股藍(lán) 150 g，麥冬 150  g，陳皮 100  g。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠按上述配方制成顆粒劑( 每包含生藥 4 g) ，分裝規(guī)格為每包 3．5 g。復(fù)方丹參滴丸( 每粒 27  mg) ，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)( 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z10950111，生產(chǎn)批號(hào) 101210) 。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒為德國(guó) Ｒoche 公司生產(chǎn)，－20 ℃ 保存，使用前置于 4 ℃溶解混合; DAB 顯色液試劑盒為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，4 ℃ 保存，使用前置于室溫與稀釋液以 1

∶ 25 稀釋混合，現(xiàn)配現(xiàn)用; 蛋白酶 K 溶液為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，－20 ℃ 保存，使用前置于 4 ℃以 1 ∶ 25 稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用; 磷酸鹽緩沖液( PBS) 為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，粉劑－ 4 ℃ 保存，使用前置于37 ℃ 與蒸餾水0 ． 01 mol / L 稀釋，pH 為7 ． 2 ～ 7．4，現(xiàn)配現(xiàn)用; 其余甲醛、酒精、二甲苯等均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，室溫避光密封保存。全自動(dòng)脫水機(jī)( 德國(guó) Leica，ASP300S) ，石蠟切片機(jī)( 德國(guó) Leica，ＲM2245) ，奧林巴斯顯微鏡( 日本  OLYMPUS， BX53) ，病理圖文攝像頭( 日本OLYMPUS，DP73) ，小動(dòng)物呼吸機(jī)( 北京智鼠多寶生物科技有限公司，DW-3000) 。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將 48 只新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為 6 組，分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥對(duì)照組［復(fù)方丹參滴丸 54 mg / ( kg·d) ］、冠通方大劑量組［3．6 g / ( kg·d) ］、冠通方中劑量組［1．8 g / ( kg·

d) ］、冠通方小劑量組［0．9 g / ( kg·d) ］，每組 8 只。用藥劑量根據(jù)人兔臨床用藥劑量換算公式［2］換算成兔用藥量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行分籠飼養(yǎng)，于每天早上灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組予蒸餾水灌胃。各組均連續(xù)灌胃14 d，于末次給藥 1 h 后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.4.2 2 模型建立 經(jīng)耳緣靜脈注射戊ba比妥鈉 30 mg / kg 麻醉后，背位固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)  Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離頸前肌， 切開(kāi)氣管，插入 Y 型氣管插管，連接微型人工 呼吸機(jī)( 潮氣量1 0 mL / kg ～ 1 5 mL / kg ，頻 率4 0次/ min) 。沿胸骨左緣 3 ～ 4 肋間隙開(kāi)胸，暴露心臟。采用 5 ～ 0 線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(  LAD)  法制備心肌缺血再灌注模型，為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌梗死面積過(guò)大導(dǎo)致死亡， 冠狀動(dòng)脈阻斷點(diǎn)應(yīng)在冠狀動(dòng)脈左前降支向下 5 mm ～ 10 mm 處選擇結(jié)扎位點(diǎn)，以心電圖出現(xiàn) ST段弓背抬高和結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗、局部節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不 良為結(jié)扎成功。待結(jié)扎 40 min 后剪斷手術(shù)線實(shí)現(xiàn)再灌注，灌注時(shí)間為 2 h。以缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅并反應(yīng)性充血、收縮活動(dòng)逐漸恢復(fù)、ST 段恢復(fù) 1 /2 以上為再灌注成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余操作同上。

1.4.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

IＲI 心肌組織 HE 染色病理切片 造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，取左心室心肌( 包括缺血邊緣區(qū)、心肌缺血區(qū)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎區(qū)心肌組織) 。將標(biāo)本置于 10% 中性甲醛液中固定，經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水 14 h，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚 4 μm，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行 HE 染色、封片，鏡下觀察心肌組織基本病理改變。

1.4.3.1 TUNEL 法染色 參考羅氏 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用 0．3%過(guò)氧化氫溶液封閉 30 min; 20 mg / L 蛋白酶 K 消化膜蛋白及核蛋白; 加入TUNEL 反應(yīng)液，37  ℃ 孵育 60  min; 加入 FITC 標(biāo)記抗體，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。

1.4.3.2 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)量   在光鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，電鏡下呈棕色顆粒者為染色陽(yáng)性的凋亡心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)觀察:  每只兔子觀察4 張切片，每張切片在高倍鏡下( 400 ×) 隨機(jī)觀察 5 個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞個(gè)數(shù)，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/ 總細(xì)胞數(shù)的百分比為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    本研究采用 SPSS Statistics 19．0 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用單因素方差分析，計(jì)量資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s ) 表示，組間比較用q 檢驗(yàn)，以P ＜

0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

各組心肌組織HE 染色病理形態(tài)比較 假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯病理?yè)p傷。MIＲI 模型組心肌細(xì)胞質(zhì)增多，細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞排列紊亂、橫紋不清，并呈現(xiàn)點(diǎn)片狀壞死灶，提示細(xì)胞壞死程度嚴(yán)重。冠通方小劑量組可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫，排列紊亂，細(xì)胞漿增多，有明顯的病理?yè)p傷。對(duì)照組和冠通方大、中劑量組心肌細(xì)胞腫脹較輕，心肌細(xì)胞偶有壞死，細(xì)胞排列有序。詳見(jiàn)圖 1。

各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較 光鏡下呈棕色的心肌細(xì)胞核為凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞，呈藍(lán)色則為非凋亡的陰性細(xì)胞。本研究結(jié)果表明: 冠通方大、中劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少。詳見(jiàn)圖 2。各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較見(jiàn)表 1。

     3 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，其參與缺血再 灌注損傷的病理過(guò)程，是缺血再灌注損傷引起心肌細(xì) 胞死亡的主要原因，成為缺血再灌注損傷影響組織心 臟功能的重要途徑和表現(xiàn)形式。已有許多研究表明， MIＲI 與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［3-5］。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡是減少缺血再灌注心肌損傷的有效途徑。

MIＲI 中醫(yī)病機(jī)包括氣虛、血瘀、痰飲不同的病理過(guò)程。謝連娣等［6］指出，氣虛導(dǎo)致血瘀和痰飲的形成， 血瘀和痰飲導(dǎo)致氣虛程度進(jìn)一步加重。急性心肌梗死 時(shí)血液供應(yīng)驟然停止，失去了血液的濡養(yǎng)和運(yùn)載; 急性心肌梗死時(shí)，血栓堵塞血液的正常運(yùn)行，邪正交爭(zhēng)，正 氣損傷; 再灌注時(shí)突然過(guò)多的血液等待運(yùn)送到組織遠(yuǎn)端，增加心臟的負(fù)擔(dān)，均導(dǎo)致氣虛的形成。心氣虛無(wú)力 推動(dòng)血液運(yùn)行，造成微血管栓塞，形成“血瘀”。氣虛血瘀可以導(dǎo)致水液代謝受到影響，水液留聚，形成“痰 飲”。多數(shù)學(xué)者亦認(rèn)為缺血再灌注損傷的過(guò)程涉及氣虛、血瘀、痰飲、痰瘀化熱化毒; 以氣虛為本，血瘀痰飲為標(biāo)。

冠通方方中田七善于**化瘀，消腫止痛，其化瘀 血而不傷新血; 丹參性寒涼血，又善**化瘀，清瘀熱， 消癰腫，除煩**;  地龍咸寒，善于**祛瘀通絡(luò)，同時(shí)又能清熱化痰;  瓜蔞甘寒微苦，善于清熱化痰，**寬胸，消腫散結(jié)，同時(shí)又具有潤(rùn)腸通便，瀉腑安臟之功;  生 曬參善于大補(bǔ)元?dú)?/span>，同時(shí)又有生津之功; 絞股藍(lán)甘苦性寒具有**養(yǎng)陰，消熱**，清熱祛痰之功;  麥冬甘苦微寒，清熱養(yǎng)陰生津;  陳皮辛散溫通，善于**燥濕化 痰。諸藥合用則具有**養(yǎng)陰，清熱**化痰，**活  血化瘀通絡(luò)之功［7］。田七又名三七，主產(chǎn)于云南、廣西 等地。現(xiàn)代基礎(chǔ)研究表明:    三七中含有三七總皂苷( PNS) ，三七的主要成分是三七總皂苷，已經(jīng)有報(bào)道關(guān)于 PNS 有良好的抗氧化作用［8］，并能抵抗自由基對(duì)心肌缺血再灌注后導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。此外，三七皂  苷可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞的受損情況， 增強(qiáng)抗氧化效果，并具有抑制血小板聚集，促進(jìn)纖維蛋  白溶酶的活性，降低血液黏度，促進(jìn)血栓溶解，改善血  液流動(dòng)的作用。顧國(guó)嶸等［9］通過(guò)酶學(xué)、形態(tài)學(xué)、**組織化學(xué)等研究表明，PNS 缺血預(yù)處理 24 h 后能明顯減少缺血-再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死和凋亡，對(duì)缺血- 再灌注心肌起到延遲保護(hù)作用，證明三七**缺血性 心臟病的基礎(chǔ)。PNS 能擴(kuò)張冠脈，增加心肌營(yíng)養(yǎng)血流量，改善心肌微循環(huán)，明顯降低心肌耗氧量。同時(shí) PNS 的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用也是其保護(hù)缺血-再灌注心肌的  重要方面。丹參的抗氧化成分有丹參酮類(lèi)、丹參素、丹  酚酸類(lèi)化合物、原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸，有研究指出［10-11］，丹參酮 Ⅱ A  可抑制細(xì)胞膜上的  NADH /NADPH 氧化酶的激活，提高超氧化物歧化酶( SOD) 的活性，**氧自由基并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。研究表明［12］ 丹參凍干粉對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入**( PCI) 后 MIＲI 有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是抑制炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮功能。

本研究通過(guò)冠通方對(duì)兔 MIＲI 心肌細(xì)胞凋亡研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，冠通方可有效發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，使 MI- ＲI 細(xì)胞凋亡趨勢(shì)下降、減少心肌病理?yè)p傷，為心肌細(xì)胞后期修復(fù)打好了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。冠通方對(duì) MIＲI 損傷心肌的保護(hù)作用是多機(jī)制、多靶點(diǎn)、綜合作用，因此冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制依然需要后續(xù)探索研究。