文章編號:1003 2754(2010)12-112402
中圖分類號:R743
短篇與個案報告 骨髓間充質(zhì)干細胞移植對缺血性腦卒中大鼠的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶的影響
郭繼東1 , 王 月2 , 信 宏2
目前關(guān)于臨床上**缺血性腦卒中的方法有早期溶栓、保護腦細胞及抗血小板聚集等方法, 有效的**措施只有極早期的溶栓**, 但是很少有患者受益。 近年發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMCs)可以分化為神經(jīng)細胞[ 1] , 使其成為**缺 血性腦卒中研究的熱點。 關(guān)于其機制的研究較多的集中于
各類生長因子及營養(yǎng)因子, 而對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)方面未見報 道。 故本研究欲觀察 BMCs移植對缺血性腦卒中大鼠的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶
(ERK)的影響。
1 資料與方法
1.1 動物與試劑 健康幼年 Wistar大鼠 5 只, 體重(120 ±10)g, 用于提取 BMCs;健康成年 Wistar大鼠 30 只, 體
重(300 ±10)g, 用于制作缺血性腦卒中模型。 所有大鼠均雌
雄不限, 且由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。 DMEM培養(yǎng)基、 胎牛血清購自
Sigma公司, 大鼠腦立體定位儀購自北京智鼠多寶公司;ERK**組化試劑盒購自武漢博士德公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠 MSCs的分離、培養(yǎng)及收集 聯(lián)**用密度梯度離心及貼壁法分離培養(yǎng)大鼠
MSCs,原代培養(yǎng)達 80%以上融合后按 1∶3傳代培養(yǎng), 選取生長良好的
1、 2、3代細胞, 用 0.25%胰蛋白酶室溫消化 5min, 用含胎牛血清的培養(yǎng)液終
止消化, PBS清洗, 1000r/min離心, 每次 5min,共離心 3 次, 然后收集培養(yǎng)的大鼠 MSCs用于移植。
1.2.2 大鼠分組及缺血性腦卒中模型制作 30 只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和 BMCs移植組, 每組 10只。 采用 Longa[ 2]方法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模 型。 麻醉清醒后 2h采用 Longa[ 2]的評分方法進行評分。 0分和4分的動物棄之不用。 假手術(shù)組只行開顱術(shù), 不凝閉大腦中動脈。
1.2.3 MSCs的移植 于造模術(shù)后 1w行細胞移植實驗。 在腦梗死側(cè)(右側(cè))殼核區(qū)于立體定向儀定位下進行直接注射移植。 移植組注射 MSCs懸液 5μl, 其他兩組大鼠于相同部位注射同等量不含細胞的 0.1mol/LPBS。
1.3 觀察指標(biāo)
1.3.1 神經(jīng)功能損傷程度評分(NSS) 分別于造模前、 移植前及移植后第
4周對各組動物進行 NSS, 評分標(biāo)準(zhǔn)參考
Chen等[ 3]方法, 主要觀察運動、感覺功能、平衡能力及生理反
射能力;總分為 18分, 正常為 0分, 分值越高其神經(jīng)損害程度越嚴(yán)重。
1.3.2 **組化染色 移植后第 4周, 每組取 5只處死大鼠取腦組織。 腦組織用生理鹽水和多聚甲醛先后經(jīng)心灌
注固定, 石蠟包埋, 冠狀切片。 嚴(yán)格按照**組化試劑盒說明書操作進行腦組織**組化染色檢測 ERK蛋白表達。 顯微鏡下任選
5個 400倍視野計數(shù)陽性細胞。1.3.3 腦梗死體積檢測
移植后第 4周, 各組剩余大鼠處死, 取腦, 于 20℃冷凍 20min, 冠狀切片, 由前到后, 共 5 張切片, 置 2%TTC液中, 37℃避光孵育 30min,梗死區(qū)不著 色, 正常腦組織染成紅色, 隨即采用 40g/L甲醛固定, 根據(jù)蒼 白區(qū)觀察梗死灶范圍 , 依據(jù)公式計算梗死面積[ 4] 。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 應(yīng)用 SPSS13.0進行方差分析和 t檢驗。
2 結(jié) 果
2.1 實驗動物數(shù)量統(tǒng)計 假手術(shù)組無動物缺失, 模型組因麻醉過量死亡 2只, BMCs移植組因術(shù)后感染死亡 1只,其余大鼠均進入結(jié)果統(tǒng)計。
2.2 各組動物 NSS 造模前各組動物 NSS比較無顯著差異(P>0.05);移植前, 模型組及移植組
NSS評分均較假手 術(shù)組增高明顯(P<0.05), 但兩組間無顯著差異(P>0.05); 移植后, 模型組*高, 其次為移植組, *低者為假手術(shù)組, 3組 間均有顯著差異(P<0.05)(見表 1)。
2.3 **組化 假手術(shù)組 ERK陽性細胞數(shù)為 13.42 ± 6.91, 明顯低于模型組 (120.33 ±30.52)和 BMCs移植組(35.85 ±12.64)(P<0.05), BMCs移植組明顯高于模型組 (P<0.05)。
2.4 腦梗死體積 假手術(shù)組未見梗死灶, 模型組梗死體積為 (53.27 ±20.64)mm3;BMCs移 植組 梗死體 積為(30.31 ±12.95)mm3, 二者差異顯著(P<0.05)。
3 討 論
成年哺乳動物的神經(jīng)細胞缺乏再生能力, 其損傷后很難 恢復(fù), 故缺血性腦卒中后如果不能在**時間改善其血供, 將導(dǎo)致缺血區(qū)神經(jīng)細胞的死亡。 干細胞移植是近年醫(yī)學(xué)上
乃至生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。 但是胚胎干細胞移植存在 倫理、法律及取材等方面的不便, 故移植**的應(yīng)用方面受 到很大限制。 BMCs是多能細胞, 具有多項分化的潛能, 在一 定誘導(dǎo)條件下可分化為多種造血外組織, 特別是中胚層和神 經(jīng)外胚層發(fā)育來源的組織細胞, 如成骨細胞、脂肪細胞以及
神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等[ 5, 6] 。 尤其是神經(jīng)元的分化方 向, 使其具有了強大的吸引力, 很多研究者都嘗試將其用于 **各類神經(jīng)**, 尤其用于**缺血性腦卒中的研究近年 更為廣泛。 研究人員考慮到
BMCs具有高度可塑性, 且取材 方便、**排斥反應(yīng)弱, 少受倫理學(xué)制約, 移植方便等特點, 將其應(yīng)用于腦梗死的**。 本研究成功地將
BMCs移植入梗死灶, 結(jié)果表明, 模型大鼠的神經(jīng)功能缺損得到明顯改善, 其梗死的大腦面積也明顯 減小, 考慮與 BMCs分化為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞有關(guān), 同 時我們未觀察到
BMCs移植對腦組織結(jié)構(gòu)的損傷。 BMCs移 植的療效顯著。 腦缺血時組織低氧缺氧, 細胞可以表現(xiàn)為壞死或凋亡, 同時細胞也會啟動修復(fù)機制對其缺氧損傷進行修復(fù)。 絲裂 原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)傳導(dǎo)途徑是與細胞增殖, 分化 及凋亡控制密切相關(guān)的細胞信號傳導(dǎo)途徑, ERK作為 MAPK 的家族成員之一, 可以介導(dǎo)細胞增殖、分化并促進細胞的存
活。 正常生理條件下 ERKs就存在于動物腦內(nèi), 可被神經(jīng)營 養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子等多種信號激活, 在**神經(jīng) 系統(tǒng)中可通過基因表達、蛋白合成等影響神經(jīng)細胞增殖分
化、突觸可塑性、軸突生長等, 并且參與多種神經(jīng)系統(tǒng)**的 病理生理過程 [ 7] 。 但是關(guān)于 ERK在缺血性腦卒中的發(fā)病過
程中到底起到保護還是損傷作用各家說法不一[ 8 ～ 10] 。 本研究結(jié)果顯示, 經(jīng)過造模以后, 大鼠腦組織中 ERK明 顯增多, 說明 ERK通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)促進缺血缺氧
時的神經(jīng)細 胞的死亡 與凋亡[ 11] 。 但是 移植入 BMCs后, 檢測結(jié)果顯示, 大鼠腦內(nèi) ERK陽性細胞數(shù)量明顯 減少, 表明 BMCs的移植抑制了 ERK通路活性 , 下調(diào) ERK蛋
白的表達, 保護缺血缺氧的神經(jīng)細胞免受炎性反應(yīng)和氧化應(yīng) 激反應(yīng)的損傷, 保護神經(jīng)細胞的功能, 從而達到**缺血性
腦卒中的目的。